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    免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)操時(shí)的幾大步驟說(shuō)明

    發(fā)布時(shí)間: 2022-10-09  點(diǎn)擊次數(shù): 632次
       對(duì)于免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),我們拿脂質(zhì)體為例,其作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。
      具體實(shí)操時(shí)的步驟如下:
      1.細(xì)胞培養(yǎng):取6cm細(xì)胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃二氧化碳培養(yǎng)密度至40%~60%,密度過(guò)大,轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞。
      2.轉(zhuǎn)染液在EP管中制備(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量):
      A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA;
      B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。
      分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。
      3.吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。
      4.轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。
      5.轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃恒溫箱置6~24小時(shí),吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
      6.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,可在48-72h細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)之后,提取細(xì)胞蛋白或者RNA,驗(yàn)證敲減/過(guò)表達(dá)效率。
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