1.制膠：

先制分離膠，再制濃縮膠，嚴格按照制膠說明書來就可以了。需要注意的一點是制膠一定要混勻！混勻！混勻！個人經驗是每加一種試劑，就混勻一下，直到最后一種試劑加完。 

對于初學者，還要區(qū)分制膠的玻璃板是 1.0cm 還是 1.5cm 的，兩者需要的制膠液體量是不一樣的。另外，玻璃板一定要洗干凈，本人平時都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗，再放在烤箱里烤干并晾至室溫。 

2.點樣：

點樣的過程很簡單，表手抖就 OK 了。再者，點樣的過程一定迅速，不然前面的樣容易彌散，雖說不至于太影響結果，但對于有強迫癥的同學來說還是比較致命的傷害。 

3.跑膠：

注意，跑膠時也會出現(xiàn)各種烏龍，如果跑了好大一會兒還不見條帶下移，請看一下你的玻璃板是否放反；如果跑膠時發(fā)現(xiàn)溫度過高，可檢查一下正負極是否連接反了。跑膠建議恒壓，80V 30min， 120V 60min（這個得具體看目的條帶的 位置，時間可相應增減） 

4.轉膜：

請牢記轉膜順序（黑色面-濾紙-海綿-膠-膜-海綿-濾紙-白色面），如若搞不清楚，可想象一下，蛋白質是帶負電荷的，應該是往正極方面跑，所以膜應該放在正極面。轉膜時要恒流， 285mA—300mA 60min。特別注意的是跑膠時恒壓，轉膜時恒流這個條件。 

5.封閉特異性抗原：

封閉和孵育抗體也是非常關鍵的步驟，封閉建議大家用 5%的脫脂奶粉， 2 個小時（或者過夜），不建議用 BSA。 

6.一抗孵育：

封閉完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封閉和抗體孵育用的蛋白，封閉用牛奶，抗體孵育用 BSA，這個條件是決定條帶是否齊整及有無雜帶的關鍵），過夜（或 2 個小時）。時間上與封閉錯開，如若封閉過夜，則一抗只需要兩個小時。 

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小時，洗的時間很重要，習慣是洗三遍，第一二三次分別是 5min、10min、15min。還要特別強調的是，孵育和洗膜用的轉速是不一樣的。孵育是低速，使膜和抗體有充分的接觸時間；洗膜時要用高速，以使膜洗得干凈。還有，一抗孵育時正面朝下，封閉和二抗孵育時都是朝上。（表問為什么，不知道，經驗之談） 

8.曝光：

當滿足了所有以上的實驗條件之后，你就可以自信滿滿地去曝光了。相信我，不管是磷酸化的還是普通的蛋白，都會出現(xiàn)平整光滑的條帶。

最后說一下配置實驗所需的各種溶液：TBST 可以買，也可以自己配置；同時 TBST 可以用 PBST 代替，即 PBS 加吐溫就可以了。封閉和抗體孵育時所用的 5%的脫脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置。洗膜時用 TBST 和 PBST，這個就不用說了吧。