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    WB過程中最重要的環(huán)節(jié)——轉(zhuǎn)膜

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-14  點(diǎn)擊次數(shù): 10182次

    ① 跑到溴酚藍(lán)距離最下緣 25px 時(shí)配電轉(zhuǎn)液(tris3.03g,甘氨酸 14.4g,甲醇 100ml,定容至 1L) 

    ② 在電轉(zhuǎn)液中剝膠,裁膠,剪膜,膜活化(甲醇 1min,去離子水 1min,電解液 15min) 

    ③ “三明治"黑板~海綿~三層濾紙~膠~膜(正面朝下,分清左右,與膠對應(yīng))~3 層濾紙~海綿 ~白板,夾緊后放入電轉(zhuǎn)槽中。(海綿,濾紙,膜需浸潤透,過程中不能干,趕趕氣泡) 

    ④ 連接電源,一定要注意紅對紅,黑對黑,定電流和時(shí)間(150mA,1h,若分子量大于 90, 再加 200mA,2h)具體情況具體分析


    經(jīng)驗(yàn)總結(jié): 

    溴酚藍(lán)跑到最終的距離是根據(jù)你所需要切的分子量決定的,假如你就只需要切一條 ACTIN(43Kda)這樣的,你*只需要跑到下膠,看到差不多 marker 分開了就可以切膠了。假如你要從最上到最下切好多條出來,你則需要把溴酚藍(lán)盡量跑到最下面,這樣 marker 容易被跑開,有利于切膠。濾紙和 PVDF 膜的裁剪必須要整齊,干凈,標(biāo)記清晰。 PVDF 膜型號(hào)的選擇要正確。如正常的 30~170kDa 的分子一般需要孔徑 0.45mm 的膜就足夠了。太小的則需要選擇孔徑為 0.22mm 的膜。關(guān)于轉(zhuǎn)膜是否要加 SDS 的問題。SDS 帶負(fù)電,加 SDS 一般是針對那些分子量大的 WB,加入 SDS 可以增加分子導(dǎo)電性,這樣更利于轉(zhuǎn)膜。 關(guān)于轉(zhuǎn)膜電流,分子是否能夠轉(zhuǎn)過去和轉(zhuǎn)膜時(shí)間沒有必要關(guān)系,而更在于轉(zhuǎn)膜電流的大小。 舉個(gè)例子,200kDa 的分子量,你用 90mAh 就算轉(zhuǎn)一年都轉(zhuǎn)不過去。


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